SEC-MALS：讓腺相關病毒 (AAV) 表征更上一層樓

文/Tosoh Bioscience應用科學家Heidi Vitrac, Ph.D.

前言

新冠疫情把病毒變成了每個人共同的一段切身經歷，盡管如此，我們仍需記住，并非所有的病毒都是危險的。事實上，一些病毒能夠起到輸送生物治療劑的作用。在進行基因治療時常會用到這項技術，可以通過修改患者基因達到治療或治愈疾病的效果。基因治療主要分為以下幾種方式：通過專業(yè)技術人員實現正?；虻目截惻c致病基因的替換，使功能異?；蚴Щ?，或向體內引入新基因或修飾基因。

選擇方案三時，病毒載體——特別是使用AAV的病毒載體，可以說是極為有用。首先，由于其固有的自然設計，病毒載體進入細胞的效率非常高。其次，該病毒載體的復制需依賴于與其他病毒的共感染，這點使其不具有致病性。最后，至少有12種不同人血清型AAV，其各自感染的細胞類型不同，使其可用于靶向特定類型細胞的治療。

AAV載體是由蛋白質和DNA組成的有著精確構造的復雜生物分子組合。理想情況下，科學家可以造出含預期單鏈DNA的細胞衣殼。但是，系統(tǒng)存在產生無任何DNA的空衣殼及部分填充的衣殼的風險，這些不良衣殼可能會導致治療無效或療效降低。因此，開發(fā)生產及測量AAV衣殼的可靠方法

是非常需要的，包括但不限于測量DNA屬性（如基因組完整性、AAV DNA修飾和衣殼中存在的部分DNA）以及衣殼自身屬性（如衣殼的特性、病毒蛋白占比、聚集體等）。這正是SEC和MALS可以發(fā)揮作用的地方，特別是在給藥試驗中基因組滴度測定及聚集體或空殼、部分和完整AAV測定方面。

SEC-MALS的威力

要了解SEC-MALS法的威力，首先要了解光散射分析的優(yōu)勢和過程。光束照射到溶液中的分子時，分子內會產生振蕩偶極子，此時光會向各個方向重新射出。一般來說，光的射出量與分子量有關；但是，散射光的強度隨其散射方向不同而有所差異。為了收集到非常精確的分子測量數據，應從多個不同角度來測量散射光。

東曹生命科學的LenS₃ MALS檢測器從極小角度（10度）、極大角度（170度）和直角，三角度散射光檢測模式，來計算分子大小。根據分子是大還是小，可以調用不同的角度。檢測器單次運行即可獲得三個關鍵質量屬性的量化數據：顆粒濃度、衣殼含量和聚集度。典型的儀器配置如圖1所示。事實上，該方法的主要優(yōu)勢是其所需的系統(tǒng)改造最小也很簡單。

分析高分子量的AAV時，首先必須選擇合適的東曹TSKgel^® SEC色譜柱才能獲得分析和鑒定各種雜質所需的合適分離度（圖2）。

然后，可以根據具體分析和需求進行深入優(yōu)化或微調。最后，SEC-MALS從三個方面為AAV表征提供最有力的方法支持：使用LenS₃實現超高靈敏度，測定完整／空殼比率時的增強準確度，及測定AAV聚集體和雜質的能力。

靈敏度和準確度

總的來說，相較于傳統(tǒng)UV檢測，LenS₃檢測的靈敏度優(yōu)勢明顯（圖3）。與UV260和UV280檢測相比，MALS法的靈敏度明顯更高，特別是檢測AAV時，由于這些病毒的分子量相當大，因此其后續(xù)在MALS中的光散射信號響應十分強。事實上，如果所選的色譜柱適當，即使?jié)舛葮O低，如每毫米粒子數僅為4×10⁹，也可以使用MALS實現檢測。另外，研究表明，直角光散射（RALS）信號和衣殼含量在較大的濃度范圍內呈明顯的線性相關，這為顆粒定量測定置信度提供了保證。

制備AAV時一般會產生三類衣殼：空衣殼（不含單鏈DNA）、部分衣殼（含完整長度基因組DNA的片段）和完整衣殼（含所需基因組材料的完整長度）。由于所需產品是完整的AAV衣殼，因此測定完整／空衣殼占比是一個關鍵的質量屬性要求。目前，SEC-MALS法尚且無法區(qū)分完整衣殼和部分衣殼，僅可區(qū)分完整衣殼和空衣殼。

好消息是，同樣的SEC-MALS法測定分子量的能力十分強大，也可用于測定AAV衣殼的DNA含量。如圖4所示，將RALS信號強度與預期百分比數據進行比較，研究人員發(fā)現RALS信號與衣殼DNA含量之間呈明顯的線性相關。簡而言之，該方法能夠精準預測分子量，將制劑中空衣殼含量降低至2%左右。

SEC-MALS法的靈敏度、準確度和精密度明顯優(yōu)于280 nm和260 nm的UV檢測法，這要歸功于科學家能夠制備出更高密度完整衣殼混合物樣品，從而產生更強的信號響應。

利用MALS還可以最大限度地降低測定DNA時的不準確度。隨著細胞內DNA含量的增加，細胞本身變得更加堅實，細胞內能量減少的檢測也變得更加容易。這些附加數據的獲取能夠增加測定完整／空衣殼比率的置信度。本質上講，SEC-MALS法更容易識別蛋白質的聚集體和片段，同樣歸功于LenS₃檢測器具有出色的靈敏度。

未來應用

AAV下游工藝的主要挑戰(zhàn)之一是有效分離所需的完整AAV與純化后的殘留雜質。如果將SEC-MALS法用于未純化樣品，能否應對這一挑戰(zhàn)？

結果顯示，大部分雜質可通過較高的UV響應（如：UV@280 nm，16分鐘內）檢測出來。但UV檢測法對于完整的AAV并不適用。事實上，由于密度問題，14.5分鐘左右時仍未檢測到AAV衣殼的UV信號。這也是SEC-MALS法發(fā)揮作用的地方，它能夠檢測和定量具有復雜基質的樣品。簡而言之，SEC-MALS法為分析各種血清型的AAV提供了高靈敏度、穩(wěn)健的工具。這一論斷對生產和質量控制兩個階段都適用。

SEC-MALS也可用于分析AAV以外的其他病毒。科學家總能想出新的基因遞送策略，東曹生命科學也總有相應策略與之應對。對小病毒顆粒研究得出了與AAV的試驗相似的結果，并實現了高效分離。東曹生命科學對這些病毒顆粒進行了高效分離和分子量測定，通過質量單位與能量換算得出12.8納米的結果——與該病毒顆粒的報告值匹配。簡而言之，SEC-MALS法不僅可應用于AAV，也為其他各種應用創(chuàng)造了無限可能。